Het analyse traject van eDNA

Het gehele analysetraject voor het aantonen van organismen m.b.v. eDNA bestaat uit twee onderdelen. Het eerste onderdeel is de monstername, het tweede deel bestaat uit eDNA isolatie en de bepaling gevolgd door de rapportage. Voor de monstername en de juiste manier van verzenden is een speciaal protocol beschikbaar. Deze kan op verzoek toegezonden worden.

Monstername
Een belangrijk onderdeel van de monstername is de bepaling van de plaats van bemonstering om de kans zo groot mogelijk te maken om DNA te vangen van het te aantonen organisme. Hierbij dient er rekening gehouden te worden met de ecologische wensen van het te bepalen organisme. De detectiekans van een soort kan enorm vergroot worden door meerdere monsters op verschillende plaatsen in één waterlichaam te nemen. DNA wordt snel afgebroken (binnen 2 dagen bij een watertemperatuur van 20 graden Celcius).

Monsterset
Sylphium molecular ecology heeft een speciale monsterset samengesteld voor het bemonsteren van waterlichamen voor eDNA bepalingen. Watermonsters worden op locatie gefiltreerd over een sterivex filter. Deze methode heeft het voordeel dat de kans op contaminatie tussen monsters tot een minimum beperkt wordt en dat er relatief weinig mee het veld in meegenomen hoeft te worden voor monstername en filtratie. De monsterset bevat naast een sterivex filter eveneens een 60 ml injectiespuit. Met deze spuit kan de monsternemer een watermonster nemen, zonder zelf het water aan te raken. Vervolgens wordt de Sterivex op de injectiespuit geplaatst en wordt het water over de Sterivex geperst. Een vacuümpomp is hierbij niet nodig. Na het toevoegen van de conserveringsvloeistof en het afsluiten van het sterivex filter met meegeleverde dopjes, blijft het monster gedurende langere tijd (enkele weken tot een paar maanden) stabiel zonder koeling. Het sterivex filter kan vervolgens verstuurd worden via Postnl naar het lab van Sylphium molecular ecology voor verdere analyse.

 

Monsterhengel
Voor de bemonstering van moeilijk bereikbare plaatsen, bijvoorbeeld begroeide en diepe oevers, heeft Sylphium molecular ecology een speciale monsterhengel ontwikkeld. In deze hengel wordt de 60 ml steriele wegwerp injectiespuit (uit de monsterset) geplaatst, waarna het water opgezogen wordt. Door gebruik te maken van deze hengel zijn geen lieslaarzen, waardpakken, een boot of andere hulpmiddelen nodig om watermonsters te nemen. Dit voorkomt DNA contaminatie tussen verschillende bemonsteringslocaties en versneld de bemonsteringstijd aanzienlijk. Na de monstername kan de injectiespuit vervangen worden en is de hengel klaar om opnieuw gebruikt te kunnen worden. Deze monsterhengel is los verkrijgbaar bij Sylphium molecular ecology. 

 

 

 

Verzenden monsters
Na monstername wordt het gefiltreerde watermonster in het Sterivexfilter ongekoeld verzonden naar het lab van Sylphium molecular ecology. Hiervoor wordt gebruik gemaakt een zakje meegeleverd met een uniek monsternummer. Aan de hand van dit nummer kan het monster achteraf geïdentificeerd worden. De monsters kunnen verzonden worden via Postnl naar:

 

 

Sylphium molecular ecology
postbus 11107
9700 CC Groningen

 

 

 

 

De bepaling, kwaliteitswaarborging en rapportage
Na aankomst op het lab, zal het eDNA uit het monster geïsoleerd worden en zal de bepaling plaatsvinden. Hierbij wordt gebruikgemaakt van de PCR techniek. Dit houdt in dat een soort specifiek stukje DNA vermeerderd wordt uit het eDNA. Afhankelijk van de gekozen analysemethode zal deze via electroforese, een specifieke probe (qPCR) of via next gen sequencing (metabarcoding) bepaald worden.

 

Kwaliteitswaarborging:
De analyses van de monsters worden in achtvoud uitgevoerd. Een monster wordt positief bevonden als minimaal één van deze analyses een positief signaal geeft. Als controles worden gebruikt:

  • Interne positieve controle (DNA toegevoegd aan de monsters, deze controle sluit vals negatieve PCR resultaten uit, die veroorzaakt worden door storende factoren in het DNA-isolaat)
  • Interne negatieve controle (gefilterd demiwater, deze controle toont eventuele contaminatie met DNA tijdens de handelingen aan.)
  • PCR positieve controle (Doelsoort DNA toegevoegd aan PCR mix, deze controle sluit vals negatieve PCR resultaten uit, door fouten in het PCR proces)
  • PCR negatieve controle (Geen monster of DNA toegevoegd, dit is een extra controle op vals positieve resultaten door contaminatie)

 

Rapportage
Sylphium molecular ecology stelt een analyse rapport op, waarin resultaten, conclusies en kwaliteitswaarborging van de daadwerkelijke analyse worden vermeld. Deze zal direct na afronden van de analyse via e-mail verzonden worden naar de opdrachtgever.