De eDNA analyses van Sylphium molecular ecology zijn ontwikkeld en gevalideerd onder de strengst mogelijke normen die horen bij DNA onderzoek. Elke analysemethode bestaat uit een verifieerbaar en uitgebreid validatie-rapport. De analyses bevatten diverse interne positieve en negatieve controles om eventuele DNA besmettingen en uitvoeringsfouten tijdens het analyseproces aan te tonen. Op deze manier zijn vals positieve en negatieve resultaten te herkennen en is ook na te gaan waar in het proces er eventueel fouten zijn gemaakt.
Van alle door Sylphium aangeboden analyses zijn validatierapporten verkrijgbaar. Hierin wordt weergeven aan welke validatiecriteria de eDNA-analyses voldoen.
Parameters voor ontwikkeling en validatie van de test:
Robuustheid
“Invloed van temperatuurschommelingen en remmende factoren in omgevingsmonsters op de prestatie en specificiteit van de primerset”
Detectielimieten
“Laagste kwantitatieve en kwalitatieve limieten waarin de analyse betrouwbaar kan worden toegepast”
Efficiëntie
“De vergelijking van wat er daadwerkelijk wordt geproduceerd met wat kan worden bereikt met hetzelfde verbruik van middelen”
Herhaalbaarheid
“De mate van overeenkomst tussen de resultaten van metingen van dezelfde gemeten hoeveelheid die zijn uitgevoerd onder verschillende meetomstandigheden”
Juistheid
“Het vermogen van de methode om te doen wat het‘ zegt ’wat het zou doen”
Controles tijdens de analyse
Test grootte
De kwalitatieve analyse van een monster wordt minimaal achtvoudig uitgevoerd. Een steekproef wordt als positief beschouwd als tenminste één van deze analyses een positief signaal geeft.
PCR positieve controle (PPC)
De PCR-positieve controle bevat gekloneerd DNA van het doelorganisme. Dit is een controle voor het controleren van de reacties tijdens analyses. Deze controle moet een positief signaal geven. Elke keer dat de kit wordt gebruikt, moeten er ten minste twee positieve controlereacties in de run worden mee opgenomen. Een positief resultaat geeft aan dat de primers en probes voor het detecteren van het doel goed werkten in dat specifieke experimentele scenario. Als een negatief resultaat wordt verkregen, zijn de testresultaten ongeldig en moeten ze worden herhaald.
PCR-negatieve controle (PNC)
Om positieve bevindingen te valideren, moet elke keer dat de kit wordt gebruikt een negatieve controlereactie worden opgenomen. Met deze controle wordt op DNA-besmettingen gecontroleerd. Deze controle moet een negatief signaal geven. Een positief signaal duidt er op dat ergens tijdens de procedure een DNA-besmetting is opgelopen. In dat geval zijn de qPCR-resultaten niet betrouwbaar en moet de analyse worden herhaald.
Interne positieve controle (IPC)
De interne positieve controle is een efficiëntiecontrole van de DNA-isolatieprocedure en een kwaliteits- en zuiverheidscontrole van het geïsoleerde DNA. De interne positieve controle is een klein stukje synthetisch DNA dat aanwezig is in de conserveringsbuffer van de eDNA-isolatiekit. De gekozen DNA-sequentie van de positieve controle is onbekend voor het aquatisch milieu en zal niet interfereren met de detectie van het doelorganisme. Met deze controle moet in alle gevallen (reacties) een positief signaal worden verkregen. Een negatief signaal duidt op remmende stoffen in het eDNA-isolaat of een fout tijdens isolatie. In dat geval moet de bemonsterings- en isolatieprocedure worden herhaald.
Procedure blanco
Tijdens DNA-isolatie wordt een aanvullende negatieve controle gebruikt. Deze controle bevat alleen conserveringsoplossing die als een normaal monster zal worden geanalyseerd. Als er met deze controle een positief signaal werd gedetecteerd, is er tijdens de isolatie een DNA-besmetting verkregen. Resultaten zijn niet meer betrouwbaar. De bemonsterings- en isolatieprocedure moet worden herhaald na het reinigen van het laboratorium en de apparatuur.
Detectielimiet (LDqPCR)
Laagste analyselimiet van de qPCR die overeenkomt met het minimumaantal DNA-kopieën in de qPCR, wat een positief resultaat geeft. Dit wordt bepaald met een verdunningsreeks van de positieve controle.
Limiet van kwantificatie (LQqPCR)
Laagste limiet van de qPCR waar met een betrouwbaarheid van 95% het aantal DNA-kopieën kan worden gekwantificeerd. Dit wordt bepaald met een verdunningsreeks van de positieve controle.